Gram Stain Procedure in Microbiology

La colorazione di Gram è un metodo differenziale di colorazione utilizzato per assegnare i batteri a uno dei due gruppi (gram-positivi e gram-negativi) in base alle proprietà delle loro pareti cellulari. È anche noto come colorazione di Gram o metodo di Gram. La procedura prende il nome dalla persona che ha sviluppato la tecnica, il batteriologo danese Hans Christian Gram.

Come funziona la Gram Stain

La procedura si basa sulla reazione tra peptidoglicano nelle pareti cellulari di alcuni batteri. La colorazione di Gram prevede la colorazione dei batteri, la fissazione del colore con un mordente, la decolorazione delle cellule e l'applicazione di una colorazione di contrasto.

1. La macchia primaria (viola cristallo) si lega al peptidoglicano, colorando le cellule viola. Entrambe le cellule gram-positive e gram-negative hanno peptidoglicano nelle loro pareti cellulari, quindi inizialmente tutti i batteri si colorano di viola.
2. Lo iodio di Gram (iodio e ioduro di potassio) viene applicato come mordente o fissativo. Le cellule Gram-positive formano un complesso di cristallo viola-iodio.
3. L'alcool o l'acetone sono usati per decolorare le cellule. I batteri Gram-negativi hanno molto meno peptidoglicano nelle loro pareti cellulari, quindi questo passaggio li rende essenzialmente incolori, mentre solo una parte del colore viene rimossa dalle cellule gram-positive, che hanno più peptidoglicano (60-90% della parete cellulare). La spessa parete cellulare delle cellule gram-positive viene disidratata dalla fase di decolorazione, facendole restringere e intrappolando il complesso di macchia-iodio all'interno.
4. Dopo la fase di decolorazione, viene applicata una colorazione di contrasto (di solito safranina, ma a volte fucsina) per colorare i batteri rosa. Entrambi i batteri gram-positivi e gram-negativi rilevano la macchia rosa, ma non è visibile sopra il viola più scuro dei batteri gram-positivi. Se la procedura di colorazione viene eseguita correttamente, i batteri Gram-positivi saranno viola, mentre i batteri Gram-negativi saranno rosa.

Scopo della tecnica di colorazione di Gram

I risultati della colorazione di Gram vengono visualizzati mediante microscopia ottica. Poiché i batteri sono colorati, non solo viene identificato il loro gruppo di colorazione Gram, ma è possibile osservarne la forma, le dimensioni e il modello di aggregazione. Questo rende la colorazione di Gram uno strumento diagnostico prezioso per una clinica medica o un laboratorio. Mentre la macchia potrebbe non identificare definitivamente i batteri, spesso sapere se sono gram-positivi o gram-negativi è sufficiente per prescrivere un antibiotico efficace.

Limitazioni della tecnica

Alcuni batteri possono essere gram-variabili o gram-indeterminati. Tuttavia, anche queste informazioni possono essere utili nel restringere l'identità batterica. La tecnica è più affidabile quando le colture hanno meno di 24 ore. Sebbene possa essere utilizzato su colture di brodo, è meglio prima centrifugarle. Il limite principale della tecnica è che produce risultati errati se si commettono errori nella tecnica. La pratica e l'abilità sono necessarie per produrre un risultato affidabile. Inoltre, un agente infettivo potrebbe non essere batterico. I patogeni eucariotici si colorano di gram-negativi. Tuttavia, la maggior parte delle cellule eucariotiche, ad eccezione dei funghi (incluso il lievito), non si attaccano alla diapositiva durante il processo.

Procedura di colorazione di Gram

materiale

• Cristallo viola (macchia primaria)
• Lo iodio di Gram (mordente, per fissare il viola cristallo nella parete cellulare)
• Etanolo o Acetone (decolorante)
• Safranin (colorante secondario o controcolore)
• Innaffi in una bottiglia di spruzzo o contagocce
• Vetrini per microscopio
• Microscopio composto

passi

1. Posizionare una piccola goccia di campione batterico su una diapositiva. Calore fissa i batteri al vetrino facendolo passare tre volte attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen. Applicare troppo calore o per troppo tempo può sciogliere le pareti cellulari dei batteri, distorcendone la forma e portando a un risultato impreciso. Se viene applicato troppo poco calore, i batteri lavano via il vetrino durante la colorazione.
2. Usa un contagocce per applicare la macchia primaria (cristallo viola) sul vetrino e lasciarlo riposare per 1 minuto. Sciacquare delicatamente il vetrino con acqua per non più di 5 secondi per rimuovere la macchia in eccesso. Risciacquare troppo a lungo può rimuovere troppo colore, mentre non risciacquare abbastanza a lungo può consentire a troppa macchia di rimanere sulle cellule gram-negative.
3. Usa un contagocce per applicare lo iodio di Gram sulla diapositiva per fissare il cristallo viola alla parete cellulare. Lascia riposare per 1 minuto.
4. Sciacquare il vetrino con alcool o acetone per circa 3 secondi, seguito immediatamente da un risciacquo delicato con acqua. Le cellule gram-negative perderanno colore, mentre le cellule gram-positive rimarranno viola o blu. Tuttavia, se il decoloratore viene lasciato troppo a lungo, tutte le celle perderanno colore!
5. Applicare la macchia secondaria, safranina, e lasciar riposare per 1 minuto. Risciacquare delicatamente con acqua per non più di 5 secondi. Le cellule gram-negative dovrebbero essere colorate di rosso o rosa, mentre le cellule gram-positive appariranno ancora viola o blu.
6. Visualizza la diapositiva utilizzando un microscopio composto. Potrebbe essere necessario un ingrandimento da 500x a 1000x per distinguere la forma e la disposizione delle cellule.

Esempi di agenti patogeni Gram-positivi e Gram-negativi

Non tutti i batteri identificati dalla colorazione di Gram sono associati a malattie, ma alcuni esempi importanti includono:

• Cocchi Gram-positivi (tondi): Staphylococcus aureus
• Cocchi Gram-negativi: Neisseria meningitidis
• Bacilli Gram-positivi (bastoncini): Bacillus anthracis
• Bacilli Gram-negativi: Escherichia coli