Come realizzare un tampone per elettroforesi TBE 10X

TBE e TAE sono usati come tamponi nella biologia molecolare, principalmente per l'elettroforesi degli acidi nucleici. I tamponi Tris sono utilizzati in condizioni di pH leggermente basiche, come per l'elettroforesi del DNA, poiché ciò mantiene il DNA solubile nella soluzione e deprotonato, quindi sarà attratto dall'elettrodo positivo e migrerà attraverso un gel. L'EDTA è un ingrediente nella soluzione perché questo agente chelante comune protegge gli acidi nucleici dalla degradazione degli enzimi. L'EDTA chelera cationi bivalenti che sono cofattori per nucleasi che possono contaminare il campione. Tuttavia, poiché il catione di magnesio è un cofattore della DNA polimerasi e degli enzimi di restrizione, la concentrazione di EDTA viene mantenuta volutamente bassa (concentrazione di circa 1 mM).

Materiale tampone per elettroforesi TBE 10X

• 108 g di Tris base [tris (idrossimetil) aminometano]
• 55 g di acido borico
• 7,5 g di EDTA, sale disodico
• Acqua deionizzata

Preparazione per il tampone per elettroforesi TBE 10X

1. Sciogliere il Tris, l'acido borico e l'EDTA in 800 ml di acqua deionizzata.
2. Diluire il tampone a 1 L. Si possono far sciogliere grumi bianchi non sciolti posizionando la bottiglia di soluzione in un bagno di acqua calda. Una barra di agitazione magnetica può aiutare il processo.

Non è necessario sterilizzare la soluzione. Sebbene le precipitazioni possano verificarsi dopo un lasso di tempo, la soluzione madre è ancora utilizzabile. È possibile regolare il pH utilizzando un pHmetro e l'aggiunta goccia a goccia di acido cloridrico concentrato (HCl). Va bene conservare il tampone TBE a temperatura ambiente, anche se potresti voler filtrare la soluzione madre attraverso un filtro da 0,22 micron per rimuovere le particelle che favorirebbero la precipitazione.

Memoria tampone per elettroforesi TBE 10X

Conservare il flacone di soluzione tampone 10X a temperatura ambiente. La refrigerazione accelererà le precipitazioni.

Utilizzo del buffer di elettroforesi TBE 10X

La soluzione viene diluita prima dell'uso. Diluire 100 mL di brodo 10X a 1 L con acqua deionizzata.

Ricetta 5X TBE Stock Solution

Il vantaggio della soluzione 5X è che è meno probabile che precipiti.

• 54 g di base Tris (Trizma)
• 27,5 grammi di acido borico
• 20 mL di soluzione EDTA 0,5 M
• Acqua deionizzata

Preparazione

1. Sciogliere la base di Tris e l'acido borico nella soluzione EDTA.
2. Regolare il pH della soluzione su 8,3 usando HCl concentrato.
3. Diluire la soluzione con acqua deionizzata per ottenere 1 litro di soluzione madre 5X. La soluzione può anche essere diluita a 1X o 0,5X per elettroforesi.

L'uso accidentale di una soluzione madre 5X o 10X produrrà scarsi risultati perché verrà generata la maggior quantità di calore. Oltre a fornire una risoluzione scadente, il campione potrebbe essere danneggiato.

Ricetta buffer TBA 0,5X

• Soluzione stock 5 TBE
• Acqua deionizzata distillata

Preparazione

Aggiungere 100 mL della soluzione 5X TBE a 900 mL di acqua deionizzata distillata. Mescolare accuratamente prima dell'uso.

limitazioni

Sebbene TBE e TAE siano comuni tamponi per elettroforesi, esistono altre opzioni per soluzioni conduttive a bassa molarità, tra cui tampone borato di litio e tampone borato di sodio. Il problema con TBE e TAE è che i buffer basati su Tris limitano il campo elettrico che può essere utilizzato in elettroforesi perché troppa carica provoca una temperatura di fuga.