La scrittura sperimentale di Stein ha guadagnato la sua credibilità con coloro che stavano creando letteratura modernista, ma solo un libro che ha scritto ha avuto un successo finanziario.
Gertrude Stein è nato il più giovane di cinque figli ad Allegheny, in Pennsylvania, da genitori ebrei-americani. Quando aveva sei mesi, la sua famiglia andò in Europa: prima a Vienna, poi a Parigi. Ha quindi imparato diverse altre lingue prima di imparare l'inglese. La famiglia tornò in America nel 1880 e Gertrude Stein crebbe a Oakland e San Francisco, in California.
Nel 1888 la madre di Gertrude Stein morì dopo una lunga battaglia contro il cancro e nel 1891 suo padre morì improvvisamente. Suo fratello maggiore, Michael, divenne custode dei fratelli più giovani. Nel 1892 Gertrude Stein e sua sorella si trasferirono a Baltimora per vivere con i parenti. La sua eredità era abbastanza per farla vivere comodamente.
Con poca educazione formale, Gertrude Stein fu ammessa come studente speciale nell'Annesso di Harvard nel 1893 (fu ribattezzato Radcliffe College l'anno successivo), mentre suo fratello Leo frequentò Harvard. Ha studiato psicologia con William James e si è laureata magna cum laude nel 1898.
Gertrude Stein ha studiato medicina alla Johns Hopkins per quattro anni, lasciando senza una laurea dopo aver avuto difficoltà con il suo ultimo anno di corsi. La sua partenza potrebbe essere stata collegata a una storia d'amore fallita con May Bookstaver, di cui Gertrude scrisse in seguito. O potrebbe essere stato che suo fratello Leo fosse già partito per l'Europa.
Nel 1903, Gertrude Stein si trasferì a Parigi per vivere con suo fratello Leo Stein. Cominciarono a collezionare arte, poiché Leo intendeva essere un critico d'arte. La loro casa al 27, rue de Fleurus, divenne sede dei loro saloni del sabato. Una cerchia di artisti si radunò attorno a loro, inclusi notabili come Picasso, Matisse e Gris, che Leo e Gertrude Stein aiutarono a portare all'attenzione pubblica. Picasso ha persino dipinto un ritratto di Gertrude Stein.
Nel 1907, Gertrude Stein conobbe Alice B. Toklas, un'altra ricca ebrea californiana, che divenne la sua segretaria, amanuense e compagna per tutta la vita. Stein ha definito la relazione un matrimonio e le note d'amore rese pubbliche negli anni '70 rivelano di più sulle loro vite intime di quanto non abbiano discusso pubblicamente durante la vita di Stein. I nomi di Stein per Toklas includevano "Baby Precious" e "Mama Woojums", e Toklas 'per Stein includevano "Mr. Cuddle-Wuddle" e "Baby Woojums".
Nel 1913, Gertrude Stein si era separata da suo fratello, Leo Stein, e nel 1914 hanno diviso l'arte che avevano raccolto insieme.
Mentre Pablo Picasso stava sviluppando un nuovo approccio artistico nel cubismo, Gertrude Stein stava sviluppando un nuovo approccio alla scrittura. Lei scrisse The Making of Americans nel 1906-1908, ma non fu pubblicato fino al 1925. Nel 1909 Gertrude Stein pubblicò Tre vite, tre storie tra cui "Melanctha" di particolare rilievo. Nel 1915 ha pubblicato Pulsante di gara, che è stato descritto come un "collage verbale".
La scrittura di Gertrude Stein ha portato la sua ulteriore fama, e la sua casa e i suoi saloni sono stati frequentati da molti scrittori e artisti, tra cui molti espatriati americani e inglesi. Insegnò a Sherwood Anderson ed Ernest Hemingway, tra gli altri, nei loro sforzi di scrittura.
Durante la prima guerra mondiale, Gertrude Stein e Alice B. Toklas continuarono a fornire un luogo di incontro per i modernisti a Parigi, ma lavorarono anche per aiutare lo sforzo bellico. Stein e Toklas hanno consegnato forniture mediche, finanziando i loro sforzi vendendo pezzi della collezione d'arte di Stein. Stein ricevette una medaglia di riconoscimento (Médaille de la Réconnaissance Francoise, 1922) dal governo francese per il suo servizio.
Dopo la guerra, fu Gertrude Stein a coniare la frase "generazione perduta" per descrivere i disincantati espatriati inglesi e americani che facevano parte del cerchio centrato attorno a Stein.
Nel 1925, Gertrude Stein parlò a Oxford e Cambridge in una serie di conferenze progettate per portarla a una più ampia attenzione. E nel 1933, ha pubblicato il suo libro, L'autobiografia di Alice B. Toklas, il primo degli scritti di Gertrude Stein ad avere successo finanziario. In questo libro, Stein assume la voce di Alice B. Toklas scrivendo di se stessa (Stein), rivelando la sua paternità solo alla fine.
Gertrude Stein si avventurò in un altro mezzo: scrisse il libretto di un'opera, "Quattro santi in tre atti", e Virgil Thomson ne scrisse la musica. Stein viaggiò in America nel 1934, tenendo conferenze e vedendo il debutto dell'opera ad Hartford, nel Connecticut, e si esibì a Chicago.
Con l'avvicinarsi della seconda guerra mondiale, le vite di Gertrude Stein e Alice B. Toklas furono cambiate. Nel 1938 Stein perse il contratto di locazione il 27, in rue de Fleurus, e nel 1939 la coppia si trasferì in una casa di campagna. Successivamente persero quella casa e si trasferirono a Culoz. Sebbene ebrea, femminista, americana e intellettuale, Stein e Toklas furono protette dai nazisti durante l'occupazione del 1940-1945 da amici ben collegati. Ad esempio, a Culoz, il sindaco non ha incluso i suoi nomi nell'elenco dei residenti dati ai tedeschi.
Stein e Toklas tornarono a Parigi prima della liberazione della Francia, e incontrarono molti soldati americani. Stein ha scritto di questa esperienza in un altro libro.
L'anno 1946 vide il debutto della seconda opera di Gertrude Stein, "La madre di tutti noi", la storia di Susan B. Anthony.
Gertrude Stein progettò di tornare negli Stati Uniti dopo la seconda guerra mondiale, ma scoprì di avere un tumore inoperabile. Muore il 27 luglio 1946.
Nel 1950, Le cose come sono, Il romanzo di Gertrude Stein sulle relazioni lesbiche, scritto nel 1903, fu pubblicato.
Alice B. Toklas visse fino al 1967, scrivendo un libro delle sue memorie prima della sua morte. Toklas fu sepolto nel cimitero di Parigi accanto a Gertrude Stein.